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25-羟基维生素D，简称25-OH VD，包括25-羟基维生素D2（25-OH VD2）和25-羟基维生素D3（25-OH VD3）作为维生素D在体内的主要代谢形式之一，由于其半衰期长、存在形式稳定而被认为是维生素D营养水平的标志物。如何快速准确检测人体内维生素D的水平越来越受到广大学者和医患人员的重视。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）具有特异性强、准确性高的特点，被认为是评价维生素D营养状况的"黄金标准"测定法。本应用案例采用Cleanert SLE 96孔板进行血清样品前处理，并使用LC-MS/MS进行样品测试，结果表明该实验方法具有良好的稳定性及可靠性，可为临床研究提供一种解决方案。
目标物信息
材料及仪器
Cleanert SLE 96孔板（300mg/well）、Cleanert M96 生物样品前处理仪、Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪、96孔接收板及Durashell C18-L（3.0*50 mm, 5 μm, 150 Å）均来自天津博纳艾杰尔科技有限公司；LC-MS/MS, QTRAP 5500（SCIEX）；25-OH VD2，25-OH VD3，d3-25-OH VD2以上三种标准品由合作单位提供赞助；d6-25-OH VD3（购自Altascientific）；甲醇；甲酸；水；氢氧化钠；异辛烷。
样品处理方法
样品预处理
取100 μL血清至洁净样品瓶中，加入内标溶液，再加入100 μL 50 mM氢氧化钠水溶液混匀后待净化。
SLE过程
上样：把预处理的样品全部上样，待全部浸润后静置5 min。
洗脱：用2 mL的异辛烷进行洗脱，每次洗脱加入500 μL，最后一步洗脱结束，将Cleanert SLE与收集板整体放到Cleanert M96 生物样品前处理仪上，开启压力至0.02 MPa，约30 s，完全收集洗脱液。
将洗脱液室温下用Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪进行温和氮吹干，使用200 μL 0.1% FA 甲醇/水（8/2）复溶，进样检测。
仪器检测条件
HPLC条件
色谱柱：Durashell C18-L（3.0*50 mm, 5 μm, 150 Å）
流速：500 μL/min
柱温：30 ℃
进样量：5 μL
表1 液相条件
|
Step |
Total Time(min) |
Flow Rate(µL/min) |
0.1%甲酸 水 (%) |
0.1%甲酸甲醇 (%) |
|
0 |
0 |
500 |
10 |
90 |
|
1 |
3.5 |
500 |
10 |
90 |
质谱条件
扫描模式：电喷雾电离正模式
采集模式：多反应监测（MRM）
表2 参数信息
|
化合物 |
保留时间/min |
Q1 |
Q3 |
CE |
|
25-OH VD2 |
1.81 |
413.3 |
395.3 |
13.5 |
|
413.3 |
355.4 |
14.1 |
||
|
d3-25-OH VD2 |
1.79 |
416.5 |
398.4 |
12.3 |
|
416.5 |
358.5 |
15 |
||
|
25-OH VD3 |
1.71 |
401.5 |
383.5 |
13.8 |
|
401.5 |
365.5 |
15.1 |
||
|
d6-25-OH VD3 |
1.69 |
407.5 |
389.5 |
13.8 |
|
407.5 |
371.5 |
15.1 |
结果
线性范围与灵敏度
使用不含目标物的血清样品配制10个不同浓度的校准曲线点，25-OH VD2的浓度分别为：2、4、10、30、60、120、200、400、800、1000 ng/mL；25-OH VD3的浓度分别为：1、2、5、15、30、60、100、200、400、500 ng/mL；所得样品采用上述样品前处理方法净化样品并进行检测，获得结果见表3。
表3 线性范围及灵敏度
|
化合物 |
回归方程 |
相关系数（r2） |
方法定量限LOQ(ng/mL) |
|
25-OH VD2 |
y=0.00691x+0.043 |
0.9998 |
1.1 |
|
25-OH VD3 |
y=0.0203x+0.398 |
0.9995 |
0.16 |
方法精密度与准确度
为考察方法精密度与准确度，取低、中、高三个浓度的样本，每个浓度平行处理5个样，获得数据见表4.
表4 精密度与准确度
|
化合物 |
加标浓度 |
平均回收率 |
RSD |
|
25-OH VD2 |
4 |
101.8% |
8.3% |
|
30 |
95.6% |
7.2% |
|
|
200 |
96.8% |
4.0% |
|
|
25-OH VD3 |
2 |
100.4% |
12.9% |
|
15 |
95.0% |
6.1% |
|
|
100 |
93.5% |
4.3% |
色谱图
将经Cleanert SLE净化的样品按上述LC-MS/MS测试条件进行测试，获得谱图见图3-4.
血样中大量存在的磷脂是造成液质联用基质效应的主要原因，为考察PPT、LLE与Cleanert SLE技术去除磷脂的能力，特取磷脂两对特征离子对进行考察：496/184, 524/184，获得对比图见图5-6.
图3 25-OH VD3血清加标色谱图（浓度为15 ng/mL）
图4 25-OH VD2血清加标色谱图（浓度为30 ng/mL）
图5 PPT-LLE-SLE样品磷脂对比谱图（离子对496/184）
图6 PPT-LLE-SLE样品磷脂对比谱图（离子对524/184）
结论
本应用呈现了一种简单、高效的样品前处理方法，通过Cleanert SLE 96孔板可高通量净化血样并萃取富集脂溶性维生素D代谢物25-OH VD2与25-OH VD3，本实验方法易操作且稳定，可在临床研究及药物代谢领域替代耗时、低效的液液萃取技术。
订货信息表
|
产品名称 |
规格/包装 |
订货号 |
|
Cleanert SLE 96孔板 |
96孔板 |
HC2002SQ-9W |
|
Cleanert M96 生物样品前处理仪 |
与96孔板匹配 |
SPE-M96 |
|
Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪 |
与96孔板匹配 |
NV-96G |
|
96孔收集板 |
2 mL/well，与96孔板匹配 |
96SP2036-2 |
|
Durashell C18-L |
3.0*50mm，5μm，150 Å |
DC950503-L |
|
甲醇 |
LC-MS级, 4*2.5L |
LC230 |
|
水 |
LC-MS级，4*2.5L/箱 |
LC365 |
应用编号：YB10011
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